四環(huán)素類(lèi)檢測試劑盒

四環(huán)素類(lèi)檢測試劑盒使用說(shuō)明書(shū)（酶聯(lián)免疫法）

 
1 原理及用途
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測組織、蜂蜜、雞蛋等樣本中的四環(huán)素類(lèi)藥物（Tetracyclines，TCs），試劑盒由預包被偶聯(lián)抗原的酶標板、辣根酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時(shí)，加入標準品或樣品溶液，樣本中的四環(huán)素類(lèi)藥物和酶標板上預包被偶聯(lián)抗原競爭抗四環(huán)素類(lèi)藥物抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含四環(huán)素類(lèi)藥物含量成負相關(guān)，與標準曲線(xiàn)比較即可得出樣本中四環(huán)素類(lèi)藥物的殘留量。
2 四環(huán)素類(lèi)檢測試劑盒技術(shù)指標
2.1 試劑盒靈敏度：0.05ppb(ng/ml)
2.2 反應模式：37℃，30min～30min～15min
2.3 檢測下限：
組織、肝臟、雞蛋………………0.3ppb
蜂蜜………………………………2ppb
尿樣………………………………0.5ppb
2.4 交叉反應率：
四環(huán)素………………………………100%
二甲胺四環(huán)素………………………125%
吡四環(huán)素……………………………110%
金霉素………………………………100%
脫甲基金霉素………………………35%
土霉素………………………………58%
強力霉素……………………………45%
 2.5 樣本回收率：
組織、肝臟、雞蛋…………85±20%
蜂蜜…………………………75±20%
尿樣…………………………80±20%
3 試劑盒組成
酶標板………………………96孔
標準品（黑蓋）：各1ml
0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb
高標準品（黑蓋）：1ppm…………1ml
酶標記物（紅蓋）…………………11ml
抗體工作液（藍蓋）………………5.5ml
底物液A（白蓋）……………………6ml
底物液B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
5X復溶液（黃蓋）…………………50ml
說(shuō)明書(shū)………………………………1份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：?jiǎn)蔚?0µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑：三氯乙酸、甲醇
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實(shí)驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗結果。
5.2 配液：
配液1：1%三氯乙酸溶液
    稱(chēng)取1g三氯乙酸加去離子水100ml溶解。
配液2：復溶液
    將5×復溶液用去離子水5倍稀釋?zhuān)糜跇颖镜膹腿?，復溶液?℃環(huán)境可保存一個(gè)月。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 組織、肝臟、雞蛋樣本處理方法（不用過(guò)柱）
1）用均質(zhì)器均質(zhì)組織、肝臟、雞蛋樣本；
2）稱(chēng)取2±0.05g樣本于50ml離心管中，加入6ml 1%三氯乙酸溶液，振蕩2min，室溫4000r/min以上，離心10min；
3）取出1ml上清液于另一試管中，加入1m甲醇，振蕩1min，室溫4000r/min以上，離心10min；
4）取1ml上清液在50-60℃氮氣或空氣吹干，加入1ml復溶液溶解殘留的干燥物；
5）取50 µl用于分析。
    樣本稀釋倍數：6    檢測下限：0.3ppb
5.3.2 蜂蜜樣本處理方法
1）準確稱(chēng)取1±0.05g蜂蜜樣本于離心管中，加入2ml 1%三氯乙酸，振蕩2min，室溫4000r/min以上，離心10min；
2）取出100ul上清液于另一試管中，加入1900ul復溶液稀釋?zhuān)旌?0s；
3）取50µl用于分析。
    樣本稀釋倍數：40    檢測下限：2ppb
5.3.3 尿樣本的處理方法
1）用復溶液將尿樣10倍稀釋?zhuān)ㄈ绻驑訙啙嵋欢ㄒ^(guò)濾或離心10min，4000r/min，直至得到清亮尿樣），暫不使用的樣本應冷凍保存。
2）取50µl稀釋的尿樣用于分析。
    樣本稀釋倍數：10    檢測下限：0.5ppb
6 酶聯(lián)免疫試驗步驟
    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì )有結晶需恢復到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
實(shí)驗開(kāi)始前，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。
制備四環(huán)素標準應用液：將各濃度標準品分別用稀釋好的復溶液10倍稀釋成應用液，現配 現用。（如：分別取50ul各濃度標準品加450ul稀釋好的復溶液，混合均勻，即成各濃度標準品的應用液。）
6.1 編    號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個(gè)樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應：加標準品應用液或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，37℃避光反應30分鐘。
6.3 洗    滌：將孔內液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，zui后用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 加酶反應：加酶標記物100µl/孔，37℃避光反應30分鐘。
6.5 洗    滌：同上
6.6 顯    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，37℃避光顯色15分鐘。
6.7 終    止：加終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，終止反應。
6.8 測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長(cháng)450/630nm）。測定應在終止反應后10分鐘內完成。
7 結果分析
7.1 百分吸光率的計算
    標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個(gè)標準液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
 百分吸光度值（%）＝
A
×100%
A0
A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標準溶液的平均吸光度值
7.2 標準曲線(xiàn)的繪制與計算
    以標準液百分吸光率為縱坐標，對應的標準液濃度（ppb）的對數為橫坐標，繪制標準液的半對數曲線(xiàn)圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線(xiàn)中，從標準曲線(xiàn)上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中待測物的實(shí)際濃度。
    若利用試劑盒專(zhuān)業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（索?。?br />8 注意事項
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫（25℃）會(huì )導致所有標準的OD值偏低。
8.2 在洗板過(guò)程中如果出現板孔干燥的情況，則會(huì )出現標準曲線(xiàn)不成線(xiàn)性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進(jìn)行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的*性。
8.4 在所有孵育過(guò)程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線(xiàn)照射。
8.5 不要使用過(guò)了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見(jiàn)包裝盒。