1. 蛋白沉淀 蛋白能溶于水是因為其表面有親水性氨基酸，在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)處若溶液的離子強度特別高或者特別低，蛋白則傾向于從溶液中析出。硫 酸銨是沉淀蛋白zui常用的鹽，因為它在冷的緩沖液中溶解性好，冷的緩沖液有利于保持目的蛋白的活性。硫 酸銨分餾常用作試驗室蛋白純化的*步，它可以初步粗提蛋白質(zhì)，去除非蛋白成分。蛋白質(zhì)在硫 酸銨沉淀中較穩定，可以短期在這種狀態(tài)下保存中間產(chǎn)物，當前蛋白質(zhì)純化多采用這種辦法進(jìn)行粗分離翻。在規?；a(chǎn)上硫 酸銨沉淀方法仍存在一些問(wèn)題，硫 酸銨對不銹鋼器具的腐蝕性很強。其他的鹽如硫 酸鈉不存在這種問(wèn)題，但其純化效果不如硫 酸銨。除了鹽析外蛋白還可以用多聚物如PEG和防凍劑沉淀出來(lái)，PEG是一種惰性物質(zhì)，同硫 酸銨一樣對蛋白有穩定效果，在緩慢攪拌下逐漸提高冷的蛋白溶液中的PEG濃度，蛋白沉淀可通過(guò)離心或過(guò)濾獲得，蛋白可在這種狀態(tài)下長(cháng)期保存而不損壞。蛋白沉淀對蛋白純化來(lái)說(shuō)并不是多么好的方法，因為它只能達到幾倍的純化效果，而我們在達到目的前需要上千倍的純化。其好處是可以把蛋白從混雜有蛋白酶和其他有害雜質(zhì)的培養基及細胞裂解物中解脫出來(lái)。

2. 緩沖液的更換 雖然更換緩沖液不能提高蛋白純度，但它卻在蛋白純化方案中起著(zhù)極其重要的作用。不同的蛋白純化方法需要不同pH及不同離子強度的緩沖液。假如你用硫 酸銨將蛋白沉淀出來(lái)，毫無(wú)疑問(wèn)蛋白是處在高鹽環(huán)境中，需要想辦法脫鹽，可用的方法有利用半透膜透析，通過(guò)勤換透析液體去除鹽分，此法尚可，但需幾個(gè)小時(shí)，通常要過(guò)夜，也難以用予大規模純化中。新型的設備將透析膜夾在兩個(gè)板中間，板的一側加緩沖液，另一側加需脫鹽的蛋白溶液，并在蛋白溶液一側通過(guò)泵加壓，可以使兩側溶液在數小時(shí)內達到平衡，若增加對蛋白溶液的壓力，還可迫使水分和鹽更多通過(guò)透析膜進(jìn)入透析液達到對蛋白濃縮的目的。也有出售的脫鹽柱，柱內的填料是小孔徑的顆粒，蛋白分子不能進(jìn)入孔內，先于高濃度鹽離子從柱中流出，從而使二者分離。蛋白純化的每一步都會(huì )造成目的蛋白的丟失，緩沖液平衡的步驟尤甚。蛋白會(huì )結合在任何它能接觸的表面上，剪切力、起泡沫和離子強度的快速變化很容易讓蛋白失活。
3.離子交換色譜 這是在所有的蛋白純化與濃縮方法中zui有效方法?；诘鞍着c離子交換樹(shù)脂間的相互電荷作用，通過(guò)選擇不同的緩沖液，同一種蛋白既可以和陰離子交換樹(shù)脂(能結合帶負電荷的分子)結合，也可以和陽(yáng)離子交換樹(shù)脂結合。樹(shù)脂所用的帶電基團有四種：二乙基氨基乙基用于弱的陰離子交換樹(shù)脂；羧甲基用于弱的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂；季銨用于強陰離子交換樹(shù)脂；甲基磺酸酯用于強陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。蛋白質(zhì)由氨基酸組成，氨基酸在不同的pH環(huán)境中所帶總電荷不同。大多數蛋白在生理pH(pH6～8)下帶負電荷，需用陰離子交換柱純化，的pH下蛋白會(huì )變性失活.應盡量避免。由于在某個(gè)特定的pH下不同的蛋白所帶電荷數不同，與樹(shù)脂的結合力也不同，隨著(zhù)緩沖液中鹽濃度的增加或pH的變化，蛋白按結合力的強弱被依次洗脫。在工業(yè)化生產(chǎn)中更多地是改變鹽濃度而不是去改變pH值，因為前者更容易控制。在實(shí)驗室中幾乎總是用鹽濃度梯度去洗脫離子交換柱，利用泵的輔助可以使流入柱的緩沖液中鹽濃度平穩地上升，當離子強度能夠中和蛋白的電荷時(shí)，蛋白就被從柱上洗脫下來(lái)。但在工業(yè)生產(chǎn)中鹽濃度很難控制，所以常用分步洗脫而不足連續升高的鹽梯度。與排阻層析相比，離子交換特異性更好，有更多的參數可以調整以獲得*的純化效果，樹(shù)脂也比較便宜。值得一提的是，即便是用zui控制的條件，僅用離子交換單一的方法也得不到純的蛋白，還需要其他的純化步驟。

4. 親和層析 親和層析基于目的蛋白與固相化的配基特異結合而滯留，其他雜蛋白會(huì )流過(guò)柱子。本方法存在的問(wèn)題是：?jiǎn)慰狗浅０嘿F，而且也需先純化；單抗與目的蛋白結合力太強.要用苛刻的條件來(lái)洗脫，這會(huì )使目的蛋白失活并破壞單抗；混合物中的其他蛋白如蛋白酶也可能破壞抗體或與它們非特異結合；某些單抗也會(huì )在純化過(guò)程中從樹(shù)脂上解離下來(lái)混入產(chǎn)物中，也需要從終產(chǎn)物中去除。親和柱通常在純化過(guò)程的后期應用，此時(shí)標本體積已縮小，大部分的雜質(zhì)已經(jīng)去除。谷胱甘肽S-轉移酶(Glutathione S-transferase，GST)是zui常用的親和層析純化標簽之一，帶有此標簽的重組蛋白可用交聯(lián)谷胱甘肽的層析介質(zhì)純化，但本方法有以下缺點(diǎn)：首先，蛋白上的GST必須能合適地折疊，形成與谷胱甘肽結合的空間結構才能用此方法純化；其次，GST標簽多達220個(gè)氨基酸，如此大的標簽可能會(huì )影響表達蛋白的可溶性，使形成包涵體，這會(huì )破壞蛋白的天然結構，難于進(jìn)行結構分析，有時(shí)即便純化后再酶切去除GST標簽也不一定能解決問(wèn)題。另一種可應用的親和純化標簽是6組氨酸標簽，組氨酸的咪唑側鏈可親和結合鎳、鋅和鈷等金屬離子，在中性和弱堿性條件下帶組氨酸標簽的目的蛋白與鎳柱結合，在低pH下用咪唑競爭洗脫。組氨酸標簽與GST相比有許多優(yōu)點(diǎn)，首先，由于只有6個(gè)氨基酸，分子量很小，一般需要酶切去除：其次，可以在變性條件下純化蛋白，在高濃度的尿素和胍中仍能保持結合力；另外6組氨酸標簽無(wú)免疫原性，重組蛋白可直接用來(lái)注射動(dòng)物，也不影響免疫學(xué)分析。雖然有這么多的優(yōu)點(diǎn)，但此標簽仍有不足，如目的蛋白易形成包涵體、難以溶解、穩定性差及錯誤折疊等。鎳柱純化時(shí)金屬鎳離子容易脫落漏出混入蛋白溶液，不但會(huì )通過(guò)氧化破壞目的蛋白的氨基酸側鏈，而且柱子也會(huì )非特異吸附蛋白質(zhì)，影響純化效果。若目的蛋白可與某種碳水化合物特異結合，或者需要某種特殊的輔因子，可將該碳水化合物或輔因子固相化制成親和柱，結合后目的蛋白可用高濃度的碳水化合物或輔因子洗脫。

5. 疏水作用 層析蛋白是由疏水性和親水性氨基酸組成的。疏水性氨基酸位于蛋白空間結構的中心部位，遠離表面的水分子。親水性氨基酸殘基則位于蛋白表面。由于親水性氨基酸吸引了許多的水分子，所以通常情況下整個(gè)蛋白分子被水分子包圍著(zhù)，疏水性氨基酸不會(huì )暴露在外。在高鹽濃度的環(huán)境中蛋白的疏水性區域則會(huì )暴露并與疏水性介質(zhì)表面的疏水性配基結合。不同的蛋白疏水性不同，與疏水作用力大小也不同，通過(guò)逐漸降低緩沖液中鹽濃度沖洗柱子，在鹽濃度很低時(shí)，蛋白恢復自然狀態(tài)，疏水作用力減弱被洗脫出來(lái)。
疏水性樹(shù)脂的選擇性是由疏水性配基的結構決定的，常用的直鏈配體為烷基配體(alkyl ligands)和芳基配體(arylligands)，鏈越長(cháng)結合蛋白的能力也越強。理想樹(shù)脂種類(lèi)的選擇應根據目的蛋白的化學(xué)性質(zhì)而定，不能選擇結合力太強的樹(shù)脂，結合力太強的樹(shù)脂會(huì )很難洗脫，所以開(kāi)始時(shí)應選用中等結合力的苯基樹(shù)脂探討條件。為了使選擇合適的介質(zhì)更容易，Amersham Biosciences推出了疏水作用樹(shù)脂選擇試劑盒，里面包括5種不同的樹(shù)脂供比較。疏水層析很適合作為離子交換純化的下一個(gè)步驟，因為疏水作用層析在高鹽濃度下上樣，從離子交換得到的產(chǎn)物不需更換緩沖液即可使用。蛋白又在低鹽緩沖液中洗脫，又省去了下一步純化前的更換緩沖液的步驟，既節約了時(shí)間，又減少了蛋白的丟失。

6. 排阻層析 也叫凝膠過(guò)濾或分子篩。排阻層析柱的填充顆粒是多孔的介質(zhì)，柱中圍繞著(zhù)顆粒所能容納的液體量叫流動(dòng)相，也稱(chēng)無(wú)效體積。太大的蛋白不能進(jìn)入顆粒的孔內，只能存在于無(wú)效體積的溶液中，將會(huì )zui早從柱中洗脫出來(lái)，對這部分蛋白無(wú)純化效果。由于各種蛋白的分子大小不同，擴散進(jìn)入特定大小孔徑顆粒內的能力也各異。大的蛋白分子會(huì )被先洗脫出來(lái)，分子越小，洗脫出來(lái)的越晚。為得到*的純化效果，應將孔徑大小選在目的蛋白能在無(wú)效體積和總柱床體積的中點(diǎn)附近洗脫。排阻層析有其他方法所不具備的優(yōu)點(diǎn)，首先所能純化的蛋白分子量范圍寬，Tosoh Biosep公司的聚合物樹(shù)脂，排阻極限可達200000kD；其次，樹(shù)脂微孔的形狀適合分離球形的蛋白質(zhì)，純化過(guò)程中也不需要能引起蛋白變性的有機溶劑。應該注意的是某些蛋白不適合用凝膠過(guò)濾純化，因為本技術(shù)所用樹(shù)脂有輕度的親水性，電荷密度較高的蛋白容易吸附在上面。排阻層析從不用于純化過(guò)程的早期，因為這種方法要求標本高度濃縮，上樣量只能在柱體積的1％～4％之間，柱子要細而長(cháng)才能得到好的分離效果，樹(shù)脂本身也比較昂貴，規?；墓I(yè)生產(chǎn)中不太適用。