酶免疫技術(shù)是利用酶催化底物反應的生物放大作用，提高特異性抗原-抗體免疫學(xué)反應檢測敏感性的一種標記免疫技術(shù)。該技術(shù)所用的酶要求純度高、催化反應的轉化率高、專(zhuān)一性強、性質(zhì)穩定、來(lái)源豐富、價(jià)格不貴、制備成的酶標抗體或抗原性質(zhì)穩定，繼續保留著(zhù)它的活性部分和催化能力。在受檢標本中不存在與標記酶相同的酶。另外它的相應底物應易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測定，光吸收高。

一、酶和酶作用的底物
1.辣根過(guò)氧化酶（HRP）：HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，純化方法也不復雜。它是一種糖蛋白，含糖量約18%；分子量為44kD；是一種復合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結合而成的一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶為無(wú)色糖蛋白，在275nm波長(cháng)處有zui高吸收峰；輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，
　　在403nm波長(cháng)處有zui高吸收峰。HRP對受氫體的專(zhuān)一性很高，除H202外，僅作用于小分子醇的過(guò)氧化物和尿素的過(guò)氧化物。后者為固體，作為試劑較H202方便。
　　許多化合物可作為HRP的供氧體，在ELISA中常用的供氫體底物為鄰苯二胺（OPD）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和ABTS.OPD為在ELISA中應用zui多的底物，靈敏度高，比色方便。其缺點(diǎn)是配成應用液后穩定性差，而且具有致異變性。TMB無(wú)此缺點(diǎn)。TMB經(jīng)酶作用后由無(wú)色變藍色，目測對比鮮明；加酸停止酶反應后變，可在比色計中定量；因此應用日見(jiàn)增多。ABTS，雖然靈敏度不如0PD和TMB，但空白值很低。
2.堿性磷酸酶（AP）：是從牛腸粘膜或大腸桿菌中提取。從大腸桿菌提取的AP分子量為80kD，酶作用的zui適pH為8.0；用小牛腸黏膜提取的AP分子量為l00kD，zui適pH為9.6.一般采用對硝基苯磷酸酯（p-NPP）作為底物。它可制成片狀試劑，使用方便。產(chǎn)物為的對硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH終止酶反應后，可穩定一段時(shí)間。
　　在ELISA中應用AP系統，其敏感性一般高于應用HRP系統，空白值也較低。但由于A(yíng)P較難得到高純度制劑，穩定性較HRP低，價(jià)格較HRP高，制備酶結合物時(shí)得率較HRP低等原因，國內在ELISA中一般均采用HRP.3.其他的酶：有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基傘基-β-半乳糖苷，經(jīng)酶水解后產(chǎn)生熒光物質(zhì)4-甲基傘酮，可用熒光計檢測。熒光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP也可應用可產(chǎn)生熒光的傘基磷酸酯作底物。其缺點(diǎn)是需要熒光計測定，而且如用固相載體直接作為測定容器，此載體不可發(fā)出熒光。脲酶的特點(diǎn)是酶作用后反應液發(fā)生pH改變，可使指示劑變色；另外，在人體內沒(méi)有內源酶。

二、酶標記抗體或抗原
　　酶標記的抗原或抗體稱(chēng)為結合物（conjugate）?？乖捎诨瘜W(xué)結構不同，可用不同的方法與酶結合，如為蛋白質(zhì)抗原，基本上可參考抗體酶標記的方法。制備抗體酶結合物的方法通常有以下幾種。醫 學(xué)教育網(wǎng)原創(chuàng )
　　
1.戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團試劑，可以使酶與蛋白質(zhì)或其他抗原的氨基通過(guò)它而偶聯(lián)。戊二醛交聯(lián)可用一步法（如連接AP），也可用二步法（如連接HRP）。戊二醛一步法操作簡(jiǎn)便、有效，而且重復性好。缺點(diǎn)是交聯(lián)時(shí)分子間的比例不嚴格，大小也不一，影響效果。制備HRP抗體結合物也可用二步法，即先將HRP與戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9.5緩沖液中再與抗體作用而形成酶標抗體。此法的效率可高于一步法l0倍左右。
　　
2.過(guò)碘酸鹽氧化法：本法只用于HRP的交聯(lián)。該酶含18%碳水化合物，過(guò)碘酸鹽將其分子表面的多糖氧化為醛基。用硼氫化鈉（NaBH4）中和多余的過(guò)碘酸。酶上的醛根很活潑，可與蛋白質(zhì)結合，形成按摩爾比例結合的酶標結合物。有人認為此法為辣根過(guò)氧化物酶交聯(lián)zui有效的方法。但也有只認為由于所用試劑較為劇烈，各批實(shí)驗結果不易重復。
　　按以上方法制備的結合物一般混有未結合的酶和抗體。理論上結合物中混有游離酶不影響ELISA中zui后的酶活性測定，因經(jīng)過(guò)洗滌，非特異性吸附于固相上的游離酶已被洗去。但游離的抗體則會(huì )與酶標抗體競爭相應的固相抗原，因而減低結合到固相上的酶標抗體量。因此制備的結合物應予以純化。純化的方法較多，分離大分子混合物的方法均可應用。硫酸銨鹽析法操作簡(jiǎn)便，但效果不如用sephadexg-200凝膠過(guò)濾的好。
　　
3.標記抗體鑒定：通常采用棋盤(pán)滴定法進(jìn)行篩選，見(jiàn)第十九章。
　　
三、固相載體
　　酶免疫技術(shù)的主要試劑為固相的抗原或抗體、酶標記的抗原或抗體和與標記酶直接關(guān)聯(lián)的酶反應底物?？勺鞴滔噍d體的物質(zhì)很多，zui常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后保留原來(lái)的免疫活性。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式，在測定過(guò)程中，它作為載體和容器，不參與化學(xué)反應，加之它的價(jià)格低廉，所以被普遍采用。
　　聚苯乙烯載體的形狀主要有三種：小試管、小珠和微量反應板。小試管的特點(diǎn)是還能兼作反應的容器，zui后放入分光光度計中比色。小珠一般為直徑0.6cm的圓球，表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大增加。如用特殊的洗滌器，在洗滌過(guò)程中使圓珠滾動(dòng)淋洗，效果更好。zui常用的載體為微量反應板，于ELISA測定的產(chǎn)品也稱(chēng)為ELISA板，通用的標準板形是8×12的96孔式。為便于作少量標本的檢測，有制成8聯(lián)或l2聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標準ELISA板相同。ELISA板的特點(diǎn)是可以同時(shí)進(jìn)行大量標本的檢測，并可在特定的比色計上迅速讀出結果?，F在已有多種自動(dòng)化儀器用于微量反應板型的ELISA檢測，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對操作的標準化極為有利。
　　良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間和同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于配料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此每一批號的聚苯乙烯制品在使用前須檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng／ml）包被ELISA板各孔后，每孔內加入適當稀釋的酶標抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應后分別測每孔溶液的吸光度?？刂品磻獥l件，使各讀數在0.8左右。計算所有讀數的平均值。所有單個(gè)讀數與平均讀數之差應小于10%.與聚苯乙烯類(lèi)似的塑料為聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯板的特點(diǎn)為質(zhì)軟板薄，可切割，價(jià)廉、但光潔度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有時(shí)也略高。
　　為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣，可用以下方法加以檢驗：用其他免疫學(xué)測定方法選出一個(gè)典型的陽(yáng)性標本和一個(gè)典型的陰性標本。將它們分別進(jìn)行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預定的ELISA操作步驟進(jìn)行測定，然后比較測定結果。在哪一種載體上陽(yáng)性結果與陰性結果判別zui大，這種載體就是這一ELISA測定的zui合適的固相載體。
　　除塑料制品外，固相酶免疫測定的載體還有兩種材料：一是微孔濾膜，如硝酸纖維素膜、尼龍膜等，這類(lèi)測定形式將在本章“膜載體的酶免疫測定”中介紹。另一種載體是以含鐵的磁性微粒制作的，反應時(shí)固相微粒懸浮在溶液中，具有液相反應的速率，反應結束后用磁鐵吸引作為分離的手段，洗滌也十分方便，但需配備特殊的儀器。
　　
四、免疫吸附劑
　　固相的抗原或抗體稱(chēng)為免疫吸附劑。將抗原或抗體固相化的過(guò)程稱(chēng)為包被。由于載體的不同，包被的方法也不同。如以聚苯乙烯ELISA板為載體，通常將抗原或抗體溶于緩沖液（zui常用的為pH9.6的碳酸緩沖液）中，加于ELISA板孔中在4℃過(guò)夜，經(jīng)清洗后即可應用。如果包被液中的蛋白質(zhì)濃度過(guò)低，固相載體表面有能被此蛋白質(zhì)*覆蓋，其后加入的血清標本和酶結合物中的蛋白質(zhì)也會(huì )部分地吸附于固相載體表面，zui后產(chǎn)生非特異性顯色而導致本底偏高。在這種情況下，如在包被后再用1%～5%牛血清白蛋白包被一次，可以消除這種干擾。這一過(guò)程稱(chēng)為封閉（blocking）。包被好的ELISA板在低溫可放置一段時(shí)間而不失去其免疫活性。