（1） 顯色
顯色是ELISA中的zui后一步溫育反應，此時(shí)酶催化無(wú)色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內，陰性孔可保持無(wú)色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(cháng)而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。在定量測定中，加入底物后的反應溫度和時(shí)間應按規定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進(jìn)行，時(shí)間一般不需要嚴格控制，有時(shí)可根據陽(yáng)性對照孔和陰性對照孔的顯色情況適當縮短或延長(cháng)反應時(shí)間，及時(shí)判斷。
OPD底物顯色一般在室外溫或37℃反應20-30分鐘后即不再加深，再延長(cháng)反應時(shí)間，可使本底值增高。OPD底物液受光照會(huì )自行變色，顯色反應應避光進(jìn)行，顯色反應結束時(shí)加入終止液終止反應。OPD產(chǎn)物用硫酸終止后，顯色由橙轉向棕。
TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應觀(guān)察結果。但為保證實(shí)驗結果的穩定性，宜在規定的適當時(shí)間閱讀結果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達，隨即逐漸減弱，至2小時(shí)后即可*消退至無(wú)色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應終止。這類(lèi)終止劑尚能使藍色維持較長(cháng)時(shí)間（12-24小時(shí)）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類(lèi)酸性終止液則會(huì )使藍色轉變成，此時(shí)可用特定的波長(cháng)（450nm）測讀吸光值。
（2） 比色
比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著(zhù)的液體，然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗，需先將板置于標準96孔的座架中，才可進(jìn)行比色。在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪凈，這樣，此板就可*平妥坐入座架中。
比色時(shí)應先以蒸餾水校零點(diǎn)，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過(guò)程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計算。
比色結果的表達以往通用光密度（oplical density，OD），現按規定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長(cháng)寫(xiě)于A(yíng)字母的右下角，如OPD的吸收波長(cháng)為492nm，表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。
（3） 酶標比色儀
酶標比色儀簡(jiǎn)稱(chēng)酶標儀，通常指于測讀ELISA結果吸光度的光度計。針對固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設計。許多試劑公司配套供應酶標儀。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數的準確性、重復性、度和可測范圍、線(xiàn)性等等。優(yōu)良的酶標儀的讀數一般可到0.001，準確性為±1%，重復性達0.5%。舉例說(shuō)，若某孔測得的A值為1.083，則該孔相對于空氣的真實(shí)A值應為1.083±0.01（1.073~1.093），重復測定數次，其A值均應1.083±0.05（1.078~1.088）在之間。酶標儀的可測范圍視各酶標儀的性能而不同。普通的酶標儀在0.000~2.000，新型號的酶標儀上限拓寬達2.900，甚至更高。超出可測上限的A值常以"*"或"over"或其它符號表示。應注意可測范圍與線(xiàn)性范圍的不同，線(xiàn)性范圍常小于可測范圍，比如某一酶標儀的可測范圍為0.000~2.900，而其線(xiàn)性范圍僅0.000~2.000，這在定量ELISA中制作標準曲線(xiàn)時(shí)應予注意。
酶標儀不應安置在陽(yáng)光或強光照射下，操作時(shí)室溫宜在15~30℃，使用前先預熱儀器15-30分鐘，測讀結果更穩定。
測讀A值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長(cháng)。有的酶標儀可用雙波長(cháng)式測讀，即每孔先后測讀兩次，*次在zui適波長(cháng)（W1），第二次在不敏感波長(cháng)（W2），兩次測定間不移動(dòng)ELISA板的位置。例如OPD用492nm為W1，630nm為W2，zui終測得的A值為兩者之差（W1-W2）。雙波長(cháng)式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。