提取外周血淋巴細胞時(shí)注意事項
如果取外周血淋巴細胞 （PBMC） 進(jìn)行ELISPOT檢測，采用新鮮血液。在保證無(wú)菌操作的前提下，首先應保證取血時(shí)抗凝劑應及時(shí)充分的與血液混勻，避免血凝塊的出現?？鼓皶r(shí)提取PBMC，避免放置時(shí)間過(guò)長(cháng)，室溫下避免過(guò)夜。應選用分離效果好的淋巴細胞分離液，避免PBMC中混有過(guò)多其他細胞成分或雜質(zhì)。

外周血出現溶血后，在使用淋巴細胞分離液分離PBMC時(shí)，溶血產(chǎn)生的細胞碎片、血紅素等雜質(zhì)將極大可能懸浮于分離液的層面，在吸取PBMC時(shí)非常容易混入這些雜質(zhì)，由于混入細胞的細胞碎片和血紅素很難清洗去除，在進(jìn)行ELISPOT實(shí)驗時(shí)，有可能沉積在培養板底，嚴重影響細胞因子和抗體的結合，進(jìn)而影響實(shí)驗結果。

分離外周血淋巴細胞適合于ELISPOT試驗方法
使用淋巴細胞分離液，推薦使用進(jìn)口淋巴細胞分離液，如：Lymphoprep，或者NycoPrep 1.077（無(wú)寡糖）。避免使用紅細胞裂解液分離淋巴細胞。

從動(dòng)物脾臟組織分離淋巴細胞
取動(dòng)物脾臟組織時(shí)，應注意取材的無(wú)菌操作。分離出脾臟組織，研磨后過(guò)200目篩網(wǎng)，保證所分離的細胞為單個(gè)細胞懸液。獲得細胞懸液后應該使用相應的淋巴細胞分離液進(jìn)一步分離單個(gè)核細胞。

在ELISPOT板上，每孔我應該放置淋巴細胞的數目
在使用ConA，PHA等陽(yáng)性刺激孔中，一般放置的淋巴細胞數為 104～2×105。在使用抗原作為刺激劑的情況下，每孔細胞濃度可在1～4×105。在使用多克隆刺激劑的情況下，應適當調低細胞濃度。但由于所用刺激劑的強度和批號不同，建議初次進(jìn)行ELISPOT檢測時(shí)，對刺激劑濃度和細胞濃度設立梯度，以保證較理想的實(shí)驗結果。

對淋巴細胞進(jìn)行體外刺激預孵育、或板內同步刺激培養
1）將抗原和淋巴細胞在體外混合，刺激并預孵育，是通用的方法。預孵育的淋巴細胞，在置入ELISPOT板之前應使用復溫到37℃的培養液清洗細胞1-2次。置入ELISPOT板以后通常在37℃培養5～6小時(shí)。
2）對于高度特異性抗原，可以采用將淋巴細胞和抗原同時(shí)加入ELISPOT板孔中，37℃培養箱中，同步進(jìn)行刺激、培養、和細胞因子捕獲。淋巴細胞板內同步刺激培養的時(shí)間通常為22～24小時(shí)。

ELISPOT試驗檢測的是每一個(gè)分泌細胞因子的活化細胞。在培養細胞過(guò)程中，任何移動(dòng)、震動(dòng)（包括開(kāi)關(guān)培養箱門(mén)）都會(huì )導致細胞在培養板上的移動(dòng)，從而得到不規則斑點(diǎn)或者斑點(diǎn)花紋，影響zui終結果。因此細胞在ELISPOT培養板孵育的過(guò)程中，應注意保持培養板的靜置，不應對其移動(dòng)。

在使用抗原刺激淋巴細胞培養過(guò)程中發(fā)現培養液變黃，這種現象通常見(jiàn)于使用很強的多克隆抗原刺激淋巴細胞，某些多克隆抗原會(huì )導致淋巴細胞凋亡或者死亡，大量淋巴細胞死亡后使培養液變黃。使用這些淋巴細胞進(jìn)行后續ELISPOT試驗通常得到很低的斑點(diǎn)（SPOT）形成。換用特異性抗原后可以避免該現象。

在ELISPOT結果中出現不規則的大塊斑點(diǎn)，有的區域沒(méi)有斑點(diǎn)的原因，不規則斑點(diǎn)區域的出現一般是細胞分離不*所至，有時(shí)候采用多克隆抗原孵育的淋巴細胞也會(huì )產(chǎn)生成團現象。請確認加入到ELISPOT板中進(jìn)行孵育的是單細胞懸液。

使用開(kāi)口較大的吸頭，動(dòng)作輕柔，避免對細胞的吹打，減少剪切力對淋巴細胞的傷害。