鑒定細胞死活的方法有哪些

活細胞的鑒定在生物學(xué)和醫學(xué)上具有很重要的意義。細胞培養過(guò)程中要隨時(shí)記錄細胞的生長(cháng)情況，需要經(jīng)常測定細胞的存活率；在腫瘤細胞的研究中，為了檢驗各種藥物對腫瘤細胞的殺傷力，也需要測定腫瘤細胞的存活率。在臨床醫學(xué)中死活細胞的鑒定也有很大的應用，例如為了檢測某一男子的生育能力，測定精子細胞的存活力是比較常用的辦法。

死活細胞的鑒定方法有很多種，常用的有染色法和儀器分析法。染色法是常用的細胞死活鑒定方法，簡(jiǎn)便，易于操作。但是通過(guò)直接的形態(tài)觀(guān)察來(lái)鑒別細胞死活，實(shí)驗結果很容易受操作者的主觀(guān)因素的影響，存在一定的誤差，所以，在實(shí)際操作中也常采用一些儀器來(lái)進(jìn)行的批量檢測。

不同的死活細胞鑒定方法有各自不同具體的反應機理，但無(wú)論采用何種辦法，都是利用了死活細胞在生理機能和性質(zhì)上的差異。

常用的方法包括染色法和儀器分析法。

1 染色法

染色法分化學(xué)染色法和熒光染色法，根據染色機理的不同，染料或使死細胞著(zhù)色，或使活細胞著(zhù)色。死活細胞在生理機能和性質(zhì)上的差異主要包括：

死活細胞細胞膜通透性的差異：活細胞的細胞膜是一種選擇性膜，對細胞起保護和屏障作用，只允許物質(zhì)選擇性的通過(guò)；而細胞死亡之后，細胞膜受損，通透性增加。常用的以臺盼藍鑒別細胞死活的方法就是利用了這一性質(zhì)。臺盼藍，又稱(chēng)錐藍，是一種陰離子型染料，不能透過(guò)完整的細胞膜。所以經(jīng)臺盼藍染色后只能使死細胞著(zhù)色，而活細胞不被著(zhù)色。甲基藍有類(lèi)似的染色機理。植物細胞的質(zhì)壁分離也可鑒定死活。

死活細胞在代謝上的差異：是采用美藍染料鑒定酵母細胞死活的依據。美藍是一種無(wú)毒染料，氧化型為藍色，還原型為無(wú)色。由于活細胞中新陳代謝的作用，使細胞內具有較強的還原能力，能使美藍從藍色的氧化性變?yōu)闊o(wú)色的還原型，因此美藍染色后活的酵母細胞無(wú)色；而死細胞或代謝緩慢的老細胞，則因它們的無(wú)還原能力或還原能力極弱，使美藍處于氧化態(tài)，從而被染成藍色或淡藍色。

熒光素雙醋酸酯（FDA）是一種常用的培養動(dòng)植物細胞以及植物細胞原生質(zhì)體的生活力鑒定染料，其染色機理也利用了死活細胞在代謝上的差異：FDA本身不產(chǎn)生熒光，也無(wú)極性，能自由滲透出入完整的細胞膜。當FDA進(jìn)入活細胞后，被細胞內的脂酶分解，生成有極性的、能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)——熒光素，該物質(zhì)不能自由透過(guò)活的細胞膜，積累在細胞膜內，因而使有活力的細胞產(chǎn)生綠色熒光；而無(wú)活力的細胞因不能使FDA分解，而無(wú)法產(chǎn)生熒光。

除此之外，還有一些細胞器的專(zhuān)有染料。如液泡系的專(zhuān)有染料中性紅。中性紅是一種低毒性染料，可以使活細胞液泡著(zhù)紅色，而細胞質(zhì)和細胞核不被著(zhù)色；死細胞的液泡不被著(zhù)色或淺染，染料彌散于整個(gè)細胞中，細胞核和細胞質(zhì)被染成紅色。有時(shí)侯為了增加染色效果可以將兩種染料結合使用，如甲基藍-中性紅混合染色法。

2 儀器分析法

可采用微電極技術(shù)（利用死活細胞膜兩側電位的差異）、全自動(dòng)分析細胞記數儀和流式細胞儀等，可對細胞的死活進(jìn)行的批量檢測。

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流式細胞儀法 用來(lái)判斷細胞死活的常用熒光探針有二大類(lèi)：一類(lèi)是能透過(guò)活的細胞膜進(jìn)入細胞內而發(fā)出熒光的物質(zhì)，例如FDA可被活細胞持留而發(fā)出黃綠色熒光，若細胞有損傷 則會(huì )從細胞中流失，觀(guān)察不到熒光。另一類(lèi)是不能透過(guò)活細胞膜，但能對固定的細胞及膜有破損的細胞的核進(jìn)行染色，例如碘化丙啶（ PI,Propidium iodide ）和溴化乙錠（ EB,Ethidium bromide ）就是常用的第二類(lèi)熒光探針。碘化丙啶（PI）不能穿透細胞膜，對于具有完整細胞膜的正常細胞或凋亡細胞不能染色。而對于壞死細胞，其細胞膜的完整性喪 失，碘化丙啶（PI）可以染色壞死細胞。目前常用的一種細胞凋亡與壞死檢測試劑盒則含有Hoechst 33342和碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）兩種熒光染料。細胞發(fā)生凋亡時(shí)，染色質(zhì)會(huì )固縮，Hoechst 33342可以穿透細胞膜，染色后凋亡細胞熒光會(huì )比正常細胞明顯增強。上述兩種染料雙染后，使用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測時(shí)，正常細胞為弱紅色熒光＋弱 藍色熒光，凋亡細胞為弱紅色熒光＋強藍色熒光，壞死細胞為強紅色熒光＋強藍色熒光。