ELISA測定現通常為采用手工操作的以微孔板條為固相的測定模式，測定操作非常簡(jiǎn)單，一般涉及到標本的收集保存、試劑準備、加樣、溫育、洗板、顯色、比色、結果判斷和結果報告及解釋等方面，其中任一步驟的不當都會(huì )影響測定結果，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚?，F分述如下：
一、標本的收集和保存
用于ELISA測定的臨床標本zui為常用的是血清（漿），有時(shí)因為特定的檢測目的，也用到唾液、腦脊液、尿液、糞便等標本。目前臨床上使用血清標本測定的標志物一般有傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標志物、激素、特種蛋白、細胞因子和治療藥物等。對用于激素和治療藥物測定的血清標本的收集，要注意收集時(shí)間甚或體位有可能會(huì )對測定結果產(chǎn)生影響。如可的松在早晨4～6點(diǎn)之間，會(huì )有一峰值出現：生長(cháng)激素、促黃體激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以陣發(fā)性方式釋放，因此，在測定此類(lèi)激素時(shí)，有必要在密切相連的時(shí)間間隔內采取數份血樣本，以其中間值為測定值。又如當從臥位變?yōu)檎玖⑽粫r(shí)，血清中腎素活性將出現明顯增高。再如治療藥物的檢測，應根據藥代動(dòng)力學(xué)選擇服藥后的zui適時(shí)間抽血檢測。用于傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標志物和特種蛋白等的檢測的血清標本的收集則沒(méi)有時(shí)間和體位方面的影響，只是在處理和保存方面要考慮以下幾個(gè)方面：
（1）要注意避免出現嚴重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團，其有類(lèi)似過(guò)氧化物的活性，因此，在以HRP為標記酶的ELISA測定中，如血清標本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過(guò)程中吸附于固相，從而與后面加入的HRP底物反應顯色。
（2）樣本的采集及血清分離中要注意盡量避免細菌污染，一則細菌的生長(cháng)，其所分泌的一些酶可能會(huì )對抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用；二則一些細菌的內源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會(huì )對用相應酶作標記的測定方法產(chǎn)生非特異性干擾。
（3）血清標本如是以無(wú)菌操作分離，則可以在2～8℃下保存一周，如為有菌操作，則建議冰凍保存。樣本的長(cháng)時(shí)間保存，應在-70℃以下。
（4）冰凍保存的血清標本須注意避免因停電等造成的反復凍融。標本的反復凍融所產(chǎn)生的機械剪切力將對標本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，從而引起假陰性結果。此外，凍融標本的混勻亦應注意，不要進(jìn)行劇烈振蕩，反復顛倒混勻即可。
（5）標本在保存中如出現細菌污染所致的混濁或絮狀物時(shí)，應離心沉淀后取上清檢測。
二、試劑準備
在實(shí)驗室，對試劑準備一般不太注意，通常的做法是，在實(shí)驗時(shí)將試劑從冰箱中拿出來(lái)即用，而忽略了這種做法有可能影響后面溫育時(shí)間不夠的問(wèn)題，其直接的后果是對一些弱陽(yáng)性標本的檢測出現假陰性。因此在ELISA測定中試劑的準備zui為關(guān)鍵的是，在實(shí)驗開(kāi)始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來(lái)，在室溫下放置20分鐘以上后，再進(jìn)行測定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡。這樣做的目的，主要是為了在后面的溫育反應步驟中，能使反應微孔內的溫度能較快地達到所要求的高度，以滿(mǎn)足測定要求。其次，目前的商品ELISA試劑盒中的洗板液均需在實(shí)驗室使用時(shí)對所提供的濃縮液稀釋配制，因此稀釋時(shí)所用的蒸餾水或去離子水應保證質(zhì)量。此外，當試劑盒以OPD為底物時(shí)，則底物溶液應在反應顯色前臨時(shí)配制。
三、加血清樣本及反應試劑
在現在的ELISA商品試劑盒中，血清樣本的加入幾乎是*的要使用微量加樣器加入樣本的步驟。使用微量加樣器加樣必須注意的關(guān)鍵點(diǎn)是：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快，無(wú)法保證微量加樣的準確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區，易導致非特異吸附。濺出會(huì )對鄰近孔產(chǎn)生污染。出現氣泡則反應液界面有差異。試劑的加入在國產(chǎn)試劑盒中基本上均是從滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出現重復滴加或加在兩孔之間的現象，這樣就會(huì )在孔內的非包被區出現非特異吸附，從而引起非特異顯色。所以，有時(shí)候一份標本用相同的試劑盒這次測定為陽(yáng)性，下次測定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯誤所致四、溫育
溫育是ELISA測定中影響測定成敗zui為關(guān)鍵的一個(gè)因素。ELISA作為一種固相免疫測定，抗原抗體的結合反應在固相上進(jìn)行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原*結合，必須在一定的溫度條件下反應一定的時(shí)間。溫育所需時(shí)間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時(shí)間相對較短。zui為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。
溫育這一步是臨床ELISA測定中zui容易出現問(wèn)題的步驟。通常目前國內ELISA商品試劑盒的反應溫育時(shí)間為37℃ 30分鐘～1小時(shí)，進(jìn)口ELISA試劑盒則通常為37℃ 1～2小時(shí)才能有較*的結合，低于1小時(shí)，可能會(huì )影響測定下限。因此，關(guān)于溫育，在實(shí)際測定操作中一定要注意以下幾點(diǎn)：
要保證在設定的溫度下有足夠的反應時(shí)間。一般來(lái)說(shuō)，加完樣本和/或反應試劑后，將微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中時(shí)，孔內溫度從室溫升至37℃，需要一定的時(shí)間，尤其是在室溫比較低以及非水浴的狀態(tài)下，這段升溫時(shí)間可能還比較長(cháng)，而在臨床實(shí)驗室中，很少有人注意這個(gè)問(wèn)題，通常是將微孔板一放入溫箱即開(kāi)始計時(shí)，這樣就很容易造成實(shí)際測定中溫育時(shí)間不夠，弱陽(yáng)性樣本測不出來(lái)的問(wèn)題。曾有一地處南方的血站同行提出了一個(gè)問(wèn)題，就是在每一年的冬季總有那么一個(gè)多月的時(shí)間，在做HBsAg測定的室內質(zhì)控中，測定由衛生部臨床檢驗中心供應的1 ng/ml弱陽(yáng)性樣本時(shí)，總是測不出來(lái)，不知原因為何？這可能就與南方冬天室內溫度較低有關(guān)，此時(shí)微孔板轉入溫箱后37℃溫育時(shí)間不夠，以致弱陽(yáng)性樣本測定為陰性。因此，為保證37℃下足夠的溫育時(shí)間，臨床實(shí)驗室可自行確定本實(shí)驗室不同季節（不同室溫下）微孔板從室溫拿至溫箱后需要多長(cháng)時(shí)間孔內溫度才能達到37℃，從而適當延長(cháng)板條在溫箱中的放置時(shí)間。具體的做法是，用一小溫度計放置板孔反應溶液中測量觀(guān)察即可。