ELISA試劑盒實(shí)驗沒(méi)有檢測到陽(yáng)性信號的原因?
可能原因有
①一抗和二抗不匹配
②沒(méi)有足夠的一抗和二抗來(lái)結合目標蛋白
③封閉劑與一抗或二抗有交叉反應
④一抗不識別待檢物種蛋白
⑤抗原量不足
⑥組織中目的蛋白含量低
⑦轉膜不充分
⑧洗膜過(guò)度
⑨過(guò)度封閉使目標蛋白不能顯色
⑩一抗失效
 

相應的處理辦法分別是
①保證二抗與一抗宿主物種相同(如一抗來(lái)自小鼠，二抗須為抗小鼠抗體)
②使用高濃度抗體，4℃延長(cháng)孵育時(shí)間(如過(guò)夜)
③使用溫和的去污劑如吐溫-20或更換封閉劑(脫脂奶粉、BSA、明膠等)
④參照況明書(shū)，比對免疫原序列和蛋白序列以確?？贵w和目的蛋白會(huì )發(fā)生反應，設置陽(yáng)性對照
⑤保證每條泳道蛋白上樣量不低于20-30μg，使用蛋白酶抑制劑并設置陽(yáng)性對照
⑥ 濃縮樣本使信號zui大化
⑦使用可逆染色劑如立春紅S檢測轉膜結果，檢查轉膜操作是否正確
⑧適度洗膜
⑨預實(shí)驗選擇合適的封閉劑或縮短封閉時(shí)間
⑩使用新鮮抗體，重復使用有效濃度會(huì )降低?