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免疫標記技術(shù)是將一些既易測定又具有高度敏感性的物質(zhì)標記到特異性抗原或抗體分子上，通過(guò)這些標記物的增強放大效應來(lái)顯示反應系統中抗原或抗體的性質(zhì)與含量。常用的標記物包括熒光素、酶和放射性核素等，用這3種標記物進(jìn)行標記的免疫檢測技術(shù)被稱(chēng)為3大免疫標記技術(shù)。目前，使用的免疫標記物還有化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、鐵蛋白和膠體金等。辣根過(guò)氧化物酶 (horse radish peroxidase，簡(jiǎn)稱(chēng)HRP，EC.1.11.1.7)是植物中研究得zui深入的一種過(guò)氧化物酶，早在20世紀30年代就有人著(zhù)手從辣根中分離此酶，以后又制備出結晶。本實(shí)驗是以辣根為原料，經(jīng)過(guò)水的抽提，硫酸銨和丙酮分級分離，再經(jīng)鋅離子純化，透析除鹽，冰凍干燥，便可得到高純度的辣根過(guò)氧化物酶。

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HRP的制備
1)水提?。悍Q(chēng)取5kg用水沖刷干凈的鮮辣根(辣根皮中亦含有豐富的HRP)，用菜刀切成小碎塊，在絞肉機中絞碎1～2次。碎渣漿用1倍體積的水低溫下攪拌提取過(guò)夜(亦可采用高速抽提法)。次日用甩干機(或離心機)甩干，收集濾液，碎渣再用1/4倍體積水浸泡提取1次，合并2次濾液，測得總體積。. K0 p3 I5 F1 U" R: J
2)硫酸銨分級分離：在不斷攪拌下，每1000mL濾液中慢慢加入226g硫酸銨粉末(相當于0.40飽和度，0℃)，大約在1~2h內加完，置冷室中放置過(guò)夜。次日將上清液小心地用虹吸管移出，下面混濁液以3 000r/min離心15min，棄沉淀，合并上清液。再按每1000mL上清液加258g硫酸銨粉末(0.8飽和度)隨加隨攪拌，當硫酸銨全部溶解后，置冷室過(guò)夜。次日，虹吸出上清液，沉淀部分在冰凍離心機中以13000r/min離心20min，棄去上清液，收集沉淀。將沉淀懸浮于100~150mL蒸餾水中(加水量要使沉淀全部溶解為止)，分裝于透析袋內，放在流動(dòng)自來(lái)水中進(jìn)行透析1～2天，直到硫酸銨透析完畢為止(可用5%乙酸鋇溶液或奈氏試劑進(jìn)行檢查)。然后改換成用蒸餾水透析，中間更換2~3次，用0.1mol/L硝酸銀溶液檢查透析外液無(wú)氯離子為止。將透析液合并，在冰凍離心機中以4 000r/min離心15min，棄去沉淀，量上清液的體積。 0 c4 N; R: ^/ ~: F! T$ J7 G
3)丙酮分級分離：將上清液倒入燒杯并置冰鹽浴中，在不斷攪拌下，用細滴管沿杯壁加入1倍體積預冷至－15℃的丙酮，放置片刻，在冰凍離心機中以4000r/min離心15min，棄去沉淀。上清液再加入0.8體積(按原上清液體積)-15℃丙酮，(操作同上)，靜置后，在冰凍離心機中離心收集沉淀。將沉淀溶于少量蒸餾水中，透析除去丙酮?？傻肦Z值近于1的酶溶液。
 

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工作濃度的選擇
在免疫酶技術(shù)中，首先要確定的變異因素就是酶標記物的工作濃度。因為酶標記物濃度的很小變化，便可導致試驗結果產(chǎn)生很大的波動(dòng)。另外，由于濃度過(guò)高，可使非特異性反應增加，而濃度過(guò)低又可影響測定的敏感性。因此，正式試驗前必須準確滴定其工作濃度。
酶標記抗體的滴定方法是：將抗原(或抗體)物理吸附于固相載體上，然后將經(jīng)過(guò)一系列稀釋的酶標抗體(或抗Ig抗體)與吸附在載體上的抗原(或抗體)起反應，以酶與底物的顯色反應程度來(lái)確定酶標記抗體的效價(jià)，或稱(chēng)工作濃度。