在ELISA檢測試劑盒中一般有3次加樣步聚，即加標本，加酶結合物，加底物。加樣時(shí)應將所加物加在ELISA試劑盒板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。
    加標本一般用微量加樣器，按規定的量加入板孔中。每次加標本應更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。加酶結合物應用液和底物應用液時(shí)可用定量多道加液器，使加液過(guò)程迅速完成。在ELISA檢測試劑盒中一般有兩次抗原抗體反應，即加標本和加酶結合物后?？乖贵w反應的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育（incubation），有人稱(chēng)之為孵育，在ELISA中似不恰當。
    ELISA屬固相，抗原、抗體的結合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會(huì )，只有zui貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過(guò)程，因此需經(jīng)擴散
才能達到反應的終點(diǎn)。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應總是需要一定時(shí)間的溫育。
    溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實(shí)驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。在建立ELISA方法作反應動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，實(shí)驗表明，兩次抗原抗體反應一般在37℃經(jīng)1-2小時(shí)，ELISA檢測試劑盒產(chǎn)物的生成可達。為加速
反應，可提高反應的溫度，有些試驗在43℃進(jìn)行，但不宜采用更高的溫度?？乖贵w反應4℃更為*，在放射免疫測定中多使反應在冰箱中，以形成zui多的沉淀。但因所需時(shí)間太長(cháng)，在ELISA中一般不予采用。