一、封閉液、洗滌液及保護液的優(yōu)化
1、封閉液的優(yōu)化
采用文獻報道的方法進(jìn)行封閉，其封閉液的組成為：10mM磷酸鹽緩沖液含1%的牛血清白蛋白（BSA）。
2、 洗滌液的配制
采用文獻報道的方法配制洗滌液。
3、 酶標板保護液的優(yōu)化
酶標板經(jīng)過(guò)封閉后在低溫下僅能存放2周左右，為了延長(cháng)固相酶標板上抗原的穩定性，我們增加了一步保護酶標板的程序。在10mM的磷酸鹽中加入適量的糖、無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)、慶大霉素以及二價(jià)金屬離子，作為酶標板保護劑，在封閉完后加入保護液于4℃冰箱中孵育過(guò)夜，同時(shí)與未做保護的酶標板進(jìn)行對照，然后將保護的及未保護的酶標板置于37烘箱中放置15天，考察保護液對酶標板的穩定性的影響。
二、酶標抗體稀釋度的優(yōu)化
抗原包被濃度為4ug/ml,將酶標抗體做系列稀釋?zhuān)?：100，1：200；1：300；1：400；1：500；1：600；1：1000；經(jīng)孵育、洗滌后、顯色終止后，用自動(dòng)酶標儀分析，選擇A值為1.5左右的酶標抗體稀釋度為zui適工作濃度。
三、酶標抗體保護液的優(yōu)化
低濃度的酶標抗體極容易受到高溫、微生物、以及蛋白酶的影響而失活，嚴重影響產(chǎn)品的貨架期，過(guò)去通常將酶標抗體凍干保存，然而這樣的保存，不僅由于在凍干的過(guò)程中會(huì )影響酶標抗體的活性，而且在臨床應用中頗為不便。適當的緩沖液以及添加無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)、糖、防腐劑以及一些含氨基的化合物等都會(huì )對對酶標抗體的活性起一定的保護作用，因此我們設計了一組保護劑用于保護酶標抗體，與未添加任何糖蛋白的酶標抗體做對照，將經(jīng)保護的酶標抗體及未保護的酶標抗體置于37℃烘箱中放置6天，考察保護液對酶標抗體的影響。一、 抗體的酶標記及質(zhì)量鑒定
本試驗采用改良過(guò)碘酸鈉法將辣根過(guò)氧化物酶標記在抗體上[1]，標記完后取上清用Sephedex G200 凝膠層析進(jìn)行純化，洗脫液為0.2mol/L pH7.4的PBS，流速為15ml/h，分步收集，每支3ml，以紫外分光光度計測A280吸光度值，以洗脫體積為橫坐標，吸光值為縱坐標做圖，ELISA試劑盒收集*峰即為酶標抗體峰。標記完后用紫外分光光度計在分別在280nm、及403nm處測定酶標記物的A值，計算免疫球蛋白量、摩爾比值、酶結合率以及標記率。
四、包被用緩沖液及zui適包被抗原濃度的優(yōu)化
1、包被緩沖液的優(yōu)化
包被抗原時(shí)，為了得到*的包被效果，我們采用了碳酸鹽緩沖液（50mM ph9.6 ）、磷酸鹽緩沖液（50mM ph7.6）、以及TRIS鹽酸緩沖液（50 mM ph7.6）三種緩沖液作為包被液，抗原包被濃度為5ug/ml，及2.5ug/ml,酶標抗體工作濃度為1：400及1：300，用自動(dòng)酶標儀分析，選擇*的包被緩沖液系統。同時(shí)為了保證緩沖液能夠長(cháng)期保存，我們在包被液中添加了0.01%的硫柳汞作為防腐劑。
2、zui適抗原包被濃度的優(yōu)化
用優(yōu)化好的包被緩沖液，將包被抗原（ALB）稀釋成0.1ug/ml，1.0ug/ml，2.0ug/ml，4.0 ug/ml，6.0 ug/ml，8.0 ug/ml，10.0 ug/ml等六個(gè)濃度，包被微孔板，每孔100ul；競爭抗原濃度為4.0 ug/ml，2.0 ug/ml；酶標抗體稀釋度為1：300，經(jīng)孵育、顯色、終止后用自動(dòng)酶標儀分析。顯色的強度在一定范圍內與包被的抗原量成正比，但隨著(zhù)包被抗原濃度的增加，顯色的強度反而降低，我們選擇臨界包被值作為包被抗原量。