近年來(lái),隨著(zhù)免疫學(xué)的不斷發(fā)展以及ELISA試劑盒檢測技術(shù)的應用,對雙歧桿菌的鑒定和檢測已從傳統的平板計數方法發(fā)展到應用以抗原抗體反應為基礎的各種酶免疫檢測方法。在所有以抗原抗體反應為基礎的檢測方法中,酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是目前發(fā)展zui為迅速并且較為完善的檢測方法。
 ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記,根據酶反應底物顯色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于利用了酶的率催化反應,間接放大了免疫反應的結果,使測定具有*的靈敏度。而且,ELISA檢測是在微量板中進(jìn)行的,可以對大量樣品同時(shí)進(jìn)行檢測,節省了時(shí)間。ELISA法中的雙抗體夾心方法是常用來(lái)檢測抗原的方法。目前所報道的相關(guān)研究中,都未能對利用雙抗夾心ELISA方法檢測雙歧桿菌的反應條件進(jìn)行建立并且沒(méi)有對雙歧桿菌進(jìn)行定量檢測的研究。ELISA方法克服了傳統平板計數法的繁瑣及分子生物學(xué)檢測方法的費用昂貴等缺點(diǎn),如能開(kāi)發(fā)出其檢測雙歧桿菌的試劑盒將對實(shí)際應用將具有重要意義。
 故此,建立本課題展開(kāi)這方面的研究。 本課題中,自制并獲得了價(jià)免疫血清;建立并優(yōu)化了雙抗夾心ELISA檢測雙歧桿菌的方法;用建立起的ELISA法組裝試劑盒,對試劑盒進(jìn)行方法學(xué)評價(jià),非雙歧桿菌屬微生物對本試劑盒的檢測結果無(wú)影響,重復性良好,對雙歧桿菌的zui低檢出限為106cfu/mL（g）;檢測時(shí)間為4h;用此試劑盒檢測市售酸奶（1）、市售乳粉和自制乳粉（2）進(jìn)行檢測時(shí),與傳統菌落計數方法相比,兩種檢測方法檢測結果差異不顯著(zhù)（p0.05）;用此試劑盒對自制含雙歧桿菌的乳粉產(chǎn)品（1）進(jìn)行檢測時(shí),與傳統菌落計數方法相比,兩種檢測方法檢測結果差異顯著(zhù)（p0.05）。
 ELISA試劑盒具體研究結果如下: 
1.免疫血清的制備 制備出的兔抗長(cháng)雙歧桿菌免疫血清效價(jià)可達1:20480;鼠抗長(cháng)雙歧桿菌免疫血清效價(jià)達1:10240,均具有較高的效價(jià)。
2.雙抗夾心ELISA方法檢測雙歧桿菌zui適反應條件的建立 通過(guò)對雙抗夾心ELISA檢測方法中各反應條件進(jìn)行摸索和比較,確定*反應條件為:*包被抗體和二抗反應濃度分別為1:160和1:5120;選用NBS和1%BSA-PBS分別作為包被緩沖液和封閉緩沖液;封閉30min;酶標抗體作1:2000的稀釋之后作用90min;zui后底物反應時(shí)間為20min;并且繪制了此方法檢測雙歧桿菌的標準曲線(xiàn),得出了標準曲線(xiàn)方程:y=0.4461x-2.1503,相關(guān)系數為R2=0.9881。
3. ELISA試劑盒的組裝 試劑盒主要組分有:兔抗長(cháng)雙歧桿菌免疫血清包被并封閉的8×12孔酶標板;工作濃度鼠抗長(cháng)雙歧桿菌免疫血清;工作濃度酶標抗體;長(cháng)雙歧桿菌標準品;底物溶液;終止液;濃縮洗滌液;操作方法及說(shuō)明。 
4.試劑盒的方法學(xué)評價(jià) 對所組建的雙抗夾心ELISA檢測雙歧桿菌的試劑盒進(jìn)行了方法學(xué)評價(jià),包括:特異性、重復性、靈敏度。對分別含有4種不同雙歧桿菌和七種不含雙歧桿菌的樣品進(jìn)行檢測,非雙歧桿菌屬微生物對檢測結果沒(méi)有影響,說(shuō)明此方法具有較強的特異性;用五種不同樣品對板間及板內分別做了重復性實(shí)驗,僅有很好的幾分樣品變異系數超過(guò)10%,說(shuō)明此試劑盒具有良好的重復性;對雙歧桿菌的zui低檢出限為106cfu/mL; 
5.試劑盒的保存期實(shí)驗 通過(guò)對包被酶標板的保質(zhì)期進(jìn)行測定,實(shí)驗證明,此試劑盒能在4℃的條件下保存一年以上; 6.試劑盒在雙歧桿菌檢測中的應用 采用所組建的雙歧桿菌雙抗夾心ELISA試劑盒對市售雙歧桿菌的酸奶、奶粉及自制雙歧桿菌乳粉進(jìn)行檢測與平板計數法相比。用此試劑盒檢測市售酸奶（1）、市售乳粉和自制乳粉（2）進(jìn)行檢測時(shí),與傳統菌落計數方法相比,兩種檢測方法檢測結果差異不顯著(zhù)（p0.05）;用此試劑盒對自制含雙歧桿菌的乳粉產(chǎn)品（1）進(jìn)行檢測時(shí),與傳統菌落計數方法相比,兩種ELISA試劑盒檢測方法檢測結果差異顯著(zhù)（p0.05）。