DNA重組技術(shù)的操作步驟

一個(gè)典型的DNA重組包括五個(gè)步驟： 　?。?）目的基因的獲取 　　目前，獲取目的基因的方法主要有三種：反向轉錄法、從細胞基因組直接分離法和人工合成法。 　　反向轉錄法是利用mRNA反轉錄獲得目的基因的方法。從細胞基因組中直接分離目的基因常用"鳥(niǎo)槍法"，因為這種方法猶如用散彈打鳥(niǎo),所以又稱(chēng)"散彈槍法"。用"鳥(niǎo)槍法"分離目的基因，具有簡(jiǎn)單、方便和經(jīng)濟等優(yōu)點(diǎn)。許多病毒和原核生物、一些真核生物的基因，都用這種方法獲得了成功的分離。 化學(xué)合成目的基因是20世紀70年代以來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項新技術(shù)。應用化學(xué)合成法，可在短時(shí)間內合成目的基因?？茖W(xué)家們已相繼合成了人的生長(cháng)激素釋放抑制素、胰島素、干擾素等蛋白質(zhì)的編碼基因。 （2）DNA分子的體外重組 　　體外重組是把載體與目的基因進(jìn)行連接。例如，以質(zhì)粒作為載體時(shí)，首先要選擇出合適的限制性?xún)惹忻?，對目的基因和載體進(jìn)行切割，再以DNA連接酶使切口兩端的脫氧核苷酸連接，于是目的基因被鑲嵌進(jìn)質(zhì)粒DNA，重組形成了一個(gè)新的環(huán)狀DNA分子（雜種DNA分子）。 （3）DNA重組體的導入 把目的基因裝在載體上后，就需要把它引入到受體細胞中。導入的方式有多種，主要包括轉化、轉導、顯微注射、微粒轟擊和電擊穿孔等方式。轉化和轉導主要適用于細菌一類(lèi)的原核生物細胞和酵母這樣的低等真核生物細胞，其他方式主要應用于高等動(dòng)植物的細胞。 （4）受體細胞的篩選 由于DNA重組體的轉化成功率不是太高，因而，需要在眾多的細胞中把成功轉入DNA重組體的細胞挑選出來(lái)。應事先找到特定的標志，證明導入是否成功。（5）基因表達 目的基因在成功導入受體細胞后，它所攜帶的遺傳信息必須要通過(guò)合成新的蛋白質(zhì)才能表現出來(lái)，從而改變受體細胞的遺傳性狀。目的基因在受體細胞中要表達，需要滿(mǎn)足一些條件。例如，目的基因是利用受體細胞的核糖體來(lái)合成蛋白質(zhì)，因此目的基因上必須含有能啟動(dòng)受體細胞核糖體工作的功能片段。