免疫標記技術(shù)是將一些既易ELISA試劑盒測定又具有高度敏感性的物質(zhì)標記到特異性抗原或抗體分子上，通過(guò)這些標記物的增強放大效應來(lái)顯示反應系統中抗原或抗體的性質(zhì)與含量。常用的標記物包括熒光素、酶和放射性核素等，用這3種標記物進(jìn)行標記的ELISA試劑盒免疫檢測技術(shù)被稱(chēng)為3大免疫標記技術(shù)。目前，使用的免疫標記物還有化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、鐵蛋白和膠體金等。

1.原理

辣根過(guò)氧化物酶(HorserADIsh Peroxidase, HRP)

辣根過(guò)氧化物酶 (horse radish peroxidase，簡(jiǎn)稱(chēng)HRP，EC.1.11.1.7)是植物中研究得zui深入的一種過(guò)氧化物酶，早在20世紀30年代就有人著(zhù)手從辣根中分離此酶，以后又制備出結晶。本實(shí)驗是以辣根為原料，經(jīng)過(guò)水的抽提，硫酸銨和丙酮分級分離，再經(jīng)鋅離子純化，透析除鹽，冰凍干燥，便可得到高純度的辣根過(guò)氧化物酶。

辣根過(guò)氧化物酶是一種含亞鐵血紅素的蛋白質(zhì)，HRP廣泛分布于植物界，它是由無(wú)色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個(gè)同功酶組成，Mr在40000左右，等電點(diǎn)7.2。溶于水，溶解度為5%(W/V)，溶液呈棕紅色，透明。酶催化的zui適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在pH5左右。酶溶于水和58%以下的硫酸銨溶液。HRP可溶于0.58飽和度以下的硫酸銨溶液，ELISA試劑盒而0.62飽和度以上則不溶。該酶zui適pH7.0(對愈創(chuàng )木酚為氫給體而言)。在室溫下，HRP幾周內穩定，加熱到63℃，在15min內穩定。氧化還原電勢很低，pH6.08時(shí)，E 0 =-0.2070V，pH為7.71時(shí)，E′0 =-0.2787V。HRP的輔基和酶蛋白zui大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以OD403nm/OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。* ?# p. n2 ~1 w. X3 b

酶標記物包括酶標記抗原、酶標記抗體和酶標記SPA等。ELISA試劑盒酶標記物質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到免疫酶技術(shù)的成功與否，因此被稱(chēng)為關(guān)鍵的試劑。酶標記物中zui常用的是酶標記抗體，它是將酶與特異性抗體經(jīng)適當方法連接而成。酶標記抗體的質(zhì)量主要取決于純度好、活性強及親和力高的酶和抗體，其次要有良好的制備方法。目前，高質(zhì)量的酶(如辣根過(guò)氧化物酶，ELISA試劑盒簡(jiǎn)稱(chēng)HRP)國內已有商品供應。高質(zhì)量的抗體則可通過(guò)提取純化而獲得。在制備方法上，宜選用產(chǎn)率高、ELISA試劑盒不影響結合物的活性和不混雜干擾性物質(zhì)且操作簡(jiǎn)便易行的方法。

酶制劑及其底物

凡無(wú)毒性又能呈現有色化學(xué)反應的酶，原則上均可作為標記用。但作為標記抗體用的酶應滿(mǎn)足下列要求：

(1)來(lái)源方便，易于純化;

(2)比活性高，性質(zhì)穩定;

(3)ELISA試劑盒酶活性和量能

用簡(jiǎn)單方法測定。ELISA試劑盒目前在免疫酶技術(shù)中常用的酶為辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和鹼性磷酸酶(AP)，其次還有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和蘋(píng)果酸脫氫酶等。

由于辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，穩定，分子量小，純酶容易制備，所以zui常用。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，ELISA試劑盒它是由無(wú)色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個(gè)同功酶組成，分子量為40,000,等電點(diǎn)為PH3～9,酶催化的zui適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在PH5左右。酶溶于水和58%以下飽和度硫酸銨溶液。ELISA試劑盒HRP的輔基和酶蛋白zui大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。高純度的酶RZ值應在3.0左右(zui高可達3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，ELISA試劑盒純度并不表示酶活性，如當酶變性后，RZ值仍可不變。