凍存技術(shù)

1. 液氮法

目前，細胞凍存zui常用的技術(shù)是液氮冷凍保存法，主要采用加適量保護劑的緩慢冷凍法凍存細胞。細胞冷凍技術(shù)的關(guān)鍵是盡可能地減少細胞內水分，減少細胞內冰晶的形成。人ELISA試劑盒采用或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質(zhì)分子量小，溶解度大，易穿透細胞，可以使冰點(diǎn)下降，提高細胞膜對水的通透性，且對細胞無(wú)明顯毒性。慢速冷凍方法又可使細胞內的水分滲出細胞外，人ELISA試劑盒減少胞內形成冰結晶的機會(huì )，從而減少冰晶對細胞的損傷。

常用的細胞冷凍貯存器為液氮貯存器，規格有35L3和50L3兩種。

細胞凍存時(shí)常備的材料有：0.25%胰蛋白酶，含10%～20%的血清培養液，DMSO（分析純）或無(wú)色新鮮（121°C蒸氣高壓消毒），2mL安瓿（或細胞凍存管）、吸管、離心管、噴燈、紗布袋（或凍存管架）等。

主要操作步驟為：

（1）選擇處于對數生長(cháng)期的細胞，在凍存前一天換液。將多個(gè)培養瓶中的細胞培養液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。適時(shí)去掉胰蛋白酶，加入少量新培養液。用吸管吸取培養液反復吹打瓶壁上的細胞，使其成為均勻分散的細胞懸液。懸浮生產(chǎn)細胞則不要消化處理。然后將細胞收集于離心管中離心（1000r/min，10分鐘）。

（2）去上清液，加入含20%小牛血清的*培養基，于4℃預冷15分鐘后，逐滴加入已無(wú)菌的DMSO或，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，細胞濃度為3×106～1×107/mL之間。

（3）將上述細胞分裝于安瓿或冷凍塑料管中，安瓿裝1～1.5mL在火焰噴燈上封口，封口處要*封閉，圓滑無(wú)勾。冷凍管要將蓋子蓋緊，并標記好細胞名稱(chēng)和凍存日期，同時(shí)作好登記（日期、細胞種類(lèi)及代次、凍存支數）。

（4）將裝好細胞的安瓿或凍存管裝入沙布袋內；置于液氮容器頸口處存放過(guò)夜，次日轉入液氮中。采用控制降溫速度的方法也可采用下列步驟：先將安瓿置入4℃冰箱中2～3小時(shí)，再移至冰箱冷凍室內3～4小時(shí)（此步可省略），再吊入液氮容器頸氣態(tài)部分存放2小時(shí)，zui后沉入液氮中。

2. 分布降溫法

細胞系凍存程序：

1） 單層細胞的消化。將經(jīng)24~48小時(shí)培養已長(cháng)成單層的傳代細胞培養物棄去生長(cháng)液，加適量ATV，1~2分鐘后倒棄ATV，再加入少量ATV液，經(jīng)0.5～1分鐘倒去ATV，室溫或37oC溫箱作用2~3分鐘，視細胞解離情況，拍打細胞培養瓶。使單層細胞*解離。SP2／0瘤細胞，待生長(cháng)好后用吸管吹打，再經(jīng)1 000轉／ 分離心lO分鐘。

2） 離心洗滌：向培養瓶?jì)燃?~1 0m1預冷的MEM使細胞懸浮，人ELISA試劑盒再將其吸出置滅菌離心管中，以1 000rpm 離心8～10分鐘后棄去上清液。

3） 細胞懸液的制備：向離心管內逐滴緩慢加入預冷的凍存保護液，使細胞濃度為150~400萬(wàn)／ml，然后迅速分裝于安瓿瓶中，每瓶加量為lml。

4） 致冷凍結：將安瓿瓶放入帶有棉墊的紙盒或塑料盒內，直立置不同條件下致冷凍結果保存：

a、4oC兩小時(shí)后移至一2OoC作用2小時(shí)，再移入一4OoC4小時(shí)后在一7OoC下24小時(shí)投入液氮。

b， 一20oC4小時(shí)后移致一4OoC。C經(jīng)4小時(shí)移人一7OoC冰箱24小時(shí)，投入液氮。

c， 一4OoC4小時(shí)后移入一70oC24小時(shí)后投入液氮。

d、一20oC4小時(shí)后移入一70oC經(jīng)24小時(shí)后投入液氮中。

e、一70oC24小時(shí)后投入液氮中。

5） 液氮中保存：將凍結后的安瓿裝入預冷的小布袋中，投入液氮。為防止安瓿漂浮，可預先在小布袋中加入幾塊小卵石。

3. 玻璃化法

玻璃化保存（Vitrification）是一種超速冷凍方法。它是以極快的速度冷凍細胞，使細胞內外的游離水迅速形成玻璃樣物質(zhì)，而不形成冰晶。人ELISA試劑盒這種保存方法既避免了由于慢速降溫時(shí)導致的鹽濃度升高，又防止了由于冰晶形成造成的物理?yè)p傷，可獲得較高存活率。

玻璃化首先由Luyet在1937年提出，他認為生命是生物活體系統的原子或其他結構元的一種特殊排列．并且輕微的排列位置擾動(dòng)就會(huì )破壞平衡從而導致死亡，而結冰時(shí)的驅動(dòng)力會(huì )破壞這種特殊的排列，這就是冰凍死亡的原因。玻璃

化比凍結固化方法引起的結構變化要小，因而是一種較理想的低溫保存途徑。

1981年，Fahy首先明確提出，用高濃度的低溫保護劑溶液，可在較慢地冷卻速率以及高壓條件下實(shí)現*的玻璃化，以后又發(fā)展了一些所謂“玻璃化溶液”，使細胞、組織乃至器官等范圍廣泛的生物系統玻璃化低溫保存成為可能。

1985年，Rail和Fahy[ 目用這種玻璃化溶液使鼠胚胎玻璃化保存獲得成功，是這種技術(shù)走向實(shí)用化的突破。
復蘇技術(shù)

1. 細胞復蘇的原則

在實(shí)際操作中，凍存細胞要進(jìn)行復蘇，再培養傳代。復蘇細胞一般采用快速融化法。以保證細胞外結晶快速融化，以避免慢速融化水分滲入細胞內，再次形成胞內結晶損傷細胞。

2. 細胞復蘇的主要操作步驟

（1）佩戴眼鏡和手套，從液氮罐中取出安瓿或冷凍管。

（2）迅速放入38℃水浴中，并不時(shí)搖動(dòng)，在1分鐘內使其*融化，然后在無(wú)菌下取出細胞。

（3）在1000r/min速度下離心5～10分鐘，棄去上層液，加入適量培養液后接種于培養瓶中，接種濃度1×109/L，置37℃溫箱靜置培養，次日更換一次培養液，繼續培養，觀(guān)察生長(cháng)情況。若細胞密度較高，及時(shí)傳代?；驘o(wú)需離心直接將細胞加入瓶中，并加入培養基貼壁培養12～24小時(shí)后，充去上清，換入新鮮培養基繼續培養。

3. 注意事項

在細胞復蘇操作時(shí)，應注意融化凍存細胞速度要快，人ELISA試劑盒可不時(shí)搖動(dòng)安瓿或冷凍管，使之盡快通過(guò)zui易受損的溫度段（-5～0℃）。這樣復蘇的凍存細胞存活率高，生長(cháng)及形態(tài)良好。然而，由于凍存的細胞還受其他因素的影響，有時(shí)也會(huì )有部分細胞死亡。人ELISA試劑盒此時(shí)，可將不貼壁、飄浮在培養液上（已死亡）的細胞輕輕倒掉，再補以適量的新培養液，也會(huì )獲得較為滿(mǎn)意的結果。