◎ELISA實(shí)驗的結果受操作影響很大，每個(gè)步驟包括加樣，溫育，洗滌，顯色，酶標儀讀數均應認真負責才能充分發(fā)揮ELISA的高靈敏，強特異的優(yōu)點(diǎn)。
◎因此,應建立實(shí)驗項目的標準操作程序（SOP）。

加樣
◎加樣應用微量移液器（加樣槍?zhuān)┌匆幎ǖ牧考尤胛⒖装宓?/3處避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。
◎每次加樣應更換吸嘴，做到一人一吸頭，以免發(fā)生交叉污染;干吸頭預先在血清中抽吸三次。
◎樣本稀釋?zhuān)康氖菫榱藴p少非特異性反應，所以一定要先加稀釋液后加樣本，特別注意加樣后要在微量振蕩器上振蕩30秒鐘，同時(shí)注意防止液體溢出。如后面操作步驟中加二種以上試劑時(shí)均需振蕩混勻。
◎如用滴瓶滴加試劑應先將滴瓶搖勻并擠去*滴有氣泡的試劑后加樣。

溫育
◎抗原抗體反應需要在一定溫度下（37°C），經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間才能達到反應的平衡點(diǎn)
◎ELISA邊緣效應是由溫育形成的。所以溫育一般采用能 使反應液溫度迅速達到平衡的水浴法。一種放在水浴箱的隔板上，另一種是放在溫箱的濕盒里。水要浸至板條的1/3處，不可將板條疊加放置。
◎邊緣效應（2ng/mlHBsAg一步法三種不同溫育法的結果）
洗滌
◎ELISA是靠洗滌來(lái)達到分離結合與未結合抗原抗體復合物及酶標記物的目的，同時(shí)洗滌也可將非特異吸附的蛋白質(zhì)的干擾以及血球、細菌中的酶干擾清除掉。
◎手工洗滌一般采用浸泡方法：1）甩去孔內反應液；
2）用洗滌液過(guò)洗一遍（即注滿(mǎn)孔后即甩去）；
3）微孔重新注滿(mǎn)洗液后浸泡2-3分鐘，間歇搖動(dòng)；
4）甩去孔內液體，拍板，用紙吸干。
重復以上操作至少5次。注意各種ELISA試劑盒的洗滌液盡量不要混用。
◎洗板機洗板一定要預先把板架放平，使洗板機上的每個(gè)放液和吸液纖孔都能一致地插入孔底，將孔內液體全部吸干，同時(shí)要設置一定的浸泡時(shí)間。如出現機洗后拍板有較多殘留液時(shí)應再用手工洗2次以上。關(guān)機前要用蒸溜水沖洗管道，避免堵孔。

顯色
◎HRP催化底物的一步呈色反應，同樣需要一定的時(shí)間和溫度，
◎ 一定要按照說(shuō)明書(shū)規定的時(shí)間溫度（一般為37°C，10-15分鐘）恒定反應后終止
◎或根據臨界值質(zhì)控血清吸光度值達0.2左右使的時(shí)間而恒定反應時(shí)間.

酶標儀判讀結果
◎顯色反應終止后應立刻比色（30分鐘內）。
常見(jiàn)的顯色系統有OPD和TMB二種，以后者zui為常見(jiàn)，而TMB酸不易終止因此必須盡快比色以免影響結果。OPD終止后顯棕色，測定波長(cháng)為490nm；
TMB終止后顯，測定波長(cháng)為450nm，
二種底物的校正波長(cháng)均用630nm。
使用雙波長(cháng)的優(yōu)點(diǎn)可以消除反應板條上的劃痕手印的干擾。同時(shí)要注意反應板應用紙吸干后才能置酶標儀中比色，否則吸光度易出現負值或損壞濾光片。

報告方式
◎定性試驗 國內外為便于統一計算，一律按S/C.O方式報告，S為標本A值，C.O即Cut Off值（陽(yáng)性判定值）
◎夾心法和間接法以S/C.O≥1為陽(yáng)性；
竟爭法與中和法以S/C.O﹤1為陽(yáng)性
◎Cut Off的計算公式以ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)的為準常見(jiàn)的有：
◎A） C.O=2.1×N（當N不足0.05時(shí)按0.05計），
◎此公式由P/N>2.1換算而來(lái)，常用于夾心法。
◎B） C.O=0.5×N，從抑止率公式換算而來(lái)，
◎常用于竟爭，中和法
◎C） C.O=N+C（C為常數），用于間接法。
◎D） C.O=C×P+N（C為常數），用于間接法。此公式zui客觀(guān)，但對生產(chǎn)廠(chǎng)家要求很高，陰陽(yáng)性對照測定值要基本恒定。

定量分析 用已知量的標準品作一系列稀釋?zhuān)珽LISA測定，繪制標準曲線(xiàn)，結果以量或單位表示。
ELISA的標準曲線(xiàn)每次都要和待測標本做在同一塊板上。
◎現有的ELISA定量試劑盒標準曲線(xiàn)只有在較窄的濃度范圍內成直線(xiàn)，要得到的結果實(shí)屬不易。
因此嚴禁用定性試劑盒做定量分析。

灰區概念
把定量分析的正常值范圍引入定性分析建立灰區概念，即將CO值上下的一段區域定為陽(yáng)性可疑，需重復實(shí)驗或換試劑重測以確定其陰陽(yáng)性，如仍落在灰區范圍內則報告+（陽(yáng)性）。
灰區概念對血站系統的獻血員篩查尤為重要。
灰區的設置有二種：
1）C.O×（1±CV），
CV為該試劑的批內CV （一般在15-20%間）；
2）C.O±2s，s為實(shí)驗室做室內質(zhì)控ROC的s。

高值鉤鐮效應（HD-HOOK）
◎在二位點(diǎn)夾心ELISA中，其劑量反應曲線(xiàn)的高劑量（HIGH DOSE，HD）區段，線(xiàn)性走向不是呈平臺狀無(wú)限后延，而是向下彎曲狀，似一只鉤子或一把鐮刀（HOOK），MILES（1974） 根據此現象寫(xiě)實(shí)性地稱(chēng)之為"HD-HOOK"效應。產(chǎn)生該現象的分子機理有"分子變構說(shuō)"和"濃度效應"等推論。
◎一步法和二步法均存在， 只是前者出現的更早些，大多數是高值低吸光度，很少陰性結果。