ELISA檢測系統是免疫學(xué)反應應用到科研生產(chǎn)中zui為靈敏的技術(shù)手段，有著(zhù)十分重要的作用。操作步驟雖然看起來(lái)比較簡(jiǎn)單但是實(shí)驗過(guò)程有很多的操作要點(diǎn)需要掌握，操作步驟中如果稍有不慎，操作不合理的地方，就會(huì )造成很多問(wèn)題從而影響到檢測的準確性，大大降低試驗質(zhì)量。比如說(shuō)花板，假陽(yáng)性，全顯色，全部顯色，顯色比空白還低……這就需要我們在實(shí)驗過(guò)程中多做總結，逐步完善，還有就是要多多學(xué)習，分享學(xué)習心得。下面就大體總結一下ELISA實(shí)驗的常見(jiàn)問(wèn)題和解決方法，同大家一起分享。
1、包被原的性質(zhì)很重要，蛋白濃度，是否降解，這關(guān)系到你做出的抗體可不可以被其識別，所以保存抗原很重要，我做重組蛋白時(shí)，師兄都嚴格警告我一定要在冰浴下緩慢融化就是這個(gè)道理。還有有的包被原可能不是蛋白，對于生物素和脂類(lèi)物質(zhì)或小分子物質(zhì)我們要事先對其改造再加以包被，我把方法簡(jiǎn)要的列出如下:①親和素生物素:先親和素先包被載體，加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。②脂類(lèi)物質(zhì):可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開(kāi)蓋置冰箱過(guò)夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。③小分子必須依靠和大的蛋白載體偶聯(lián)后才能固定在固相載體上。
2、包被液的選擇，一般選擇ph9.6的碳酸鹽緩沖液。但有時(shí)由于試驗的需要，包被原的特殊性也可能采用中性的緩沖溶液來(lái)包。應注意以下原理：由于蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附結合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用，這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。具體的試驗還要有堅固的理論外也要實(shí)踐，看一下zui終可不可以應用到自己試驗當中去。常用的包被液除了剛才提到的pH9.6碳酸鹽緩沖液，還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。
3、封閉：繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑有：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉，比較價(jià)廉，可以高濃度使用（5%-10%）;還有一些稀有用到的各種動(dòng)物血清（主要為了排除相似蛋白干擾）和酪蛋白等等。但zui終選用什么，要依據試驗具體來(lái)實(shí)踐。
4、洗滌板：可以說(shuō)在ELISA操作中，洗滌是zui主要的關(guān)鍵技術(shù)。因為聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，為達到分離游離的和結合的酶標記物的目的，清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)，在洗滌時(shí)又應把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。所以在洗板時(shí)會(huì )有一定誤差，人為因素很大（當然有條件的用洗板機除外），洗的不*或串了孔，對如此靈敏的ELISA系統可是不小的影響。
5、加抗體標本（和二抗）:注意該換槍頭時(shí)換槍頭。標本稀釋一般可用pbs稀釋?zhuān)部捎梅忾]液去稀釋。如需加二抗，還要注意二抗的工作濃度，太高浪費，太低則著(zhù)色淺。
6、顯色:顯色系統又很多，我們一開(kāi)始做的時(shí)候，要選擇適宜的顯色系統。注意顯色系統酶活性底物的保存HRP結合物加硫柳泵，AP結合物可加疊氮鈉。
7、每次做盡量要把陰陽(yáng)空三個(gè)對照做好，如出現問(wèn)題也好分析。

相關(guān)知識：
1、問(wèn)：做間接Elisa法測試小鼠血清中的IgE抗體，設空白對照、和陰性對照、陽(yáng)性血清稀釋倍數為5千、1萬(wàn)、10萬(wàn)、20萬(wàn)不等，用的是生物素標記的羊抗鼠IgE抗體，和親和素的辣根過(guò)氧化物酶?？墒墙Y果除了空白對照孔沒(méi)有顏色外，其余各孔全有顏色，而且OD值都相差不大，為什么?
回答：可能原因如下：
（1） 水質(zhì)被金屬離子等污染;防止辦法盡量使用新鮮水或蒸餾水。
（2） 洗滌不充分，樣品中其它成分殘留或酶殘留;防止辦法洗滌液應注滿(mǎn)微孔，充分洗滌。
（3） 移液頭重復使用，未洗凈或消毒不*; 防止辦法移液頭一次性使用。
（4） 酶標板靈敏度過(guò)高。
（5） 一抗顯色時(shí)間的控制等等，關(guān)于ELISA的每一步都要注意才行。
2、ELISA加樣時(shí)的防錯小經(jīng)驗
（1）用一張寫(xiě)滿(mǎn)字的紙，字越多越好，比如報紙，墊在下面，這樣，加過(guò)標本的小孔看過(guò)去下面的字會(huì )變小，沒(méi)加的字正常，非常容易區分。
（2）可以利用液面反光與沒(méi)有加的孔加以區別
（3）在標本加完后，再把加樣槍全壓下，使液面產(chǎn)生小氣泡，也可以加以區分
3、棋盤(pán)試驗的操作方法:
（1）將抗原按一定的梯度倍比稀釋后，按照ELISA從上到下（或者從左到右）的順序包被。
（2）將抗體按一定的梯度倍比稀釋后按照ELISA從左到右或者從上到下加入。
（3）二抗的稀釋倍數是一定的，然后顯色，讀值。
OD值的測定時(shí)，波長(cháng)要根據顯色劑的不同而定，一般上大家都使用TMB顯色，450nm讀值。根據讀值得結果可以選定合適的抗原和抗體效價(jià)，這就是棋盤(pán) 實(shí)驗的目的，如果抗原包被量已知而二抗的工作濃度不確定的話(huà)就用一抗和二抗作棋盤(pán)試驗。