顯色是ELISA中的后一步溫育反應，此時(shí)酶催化無(wú)色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內，陰性孔可保持無(wú)色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(cháng)而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。在定量測定中，加入底物后的反應溫度和時(shí)間應按規定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進(jìn)行，時(shí)間一般不需要嚴格控制，有時(shí)可根據陽(yáng)性對照孔和陰性對照孔的顯況適當縮短或延長(cháng)反應時(shí)間，及時(shí)判斷。

OPD底物顯色一般在室外溫或37℃反應20-30分鐘后即不再加深，再延長(cháng)反應時(shí)間，可使本底值增高。OPD底物液受光照會(huì )自行變色，顯色反應應避光進(jìn)行，顯色反應結束時(shí)加入終止液終止反應。OPD產(chǎn)物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉向棕黃色。

TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應觀(guān)察結果。但為保證實(shí)驗結果的穩定性，宜在規定的適當時(shí)間閱讀結果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色，隨即逐漸減弱，至2小時(shí)后即可消退至無(wú)色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應終止。這類(lèi)終止劑尚能使藍色維持較長(cháng)時(shí)間（12-24小時(shí)）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類(lèi)酸性終止液則會(huì )使藍色轉變成黃色，此時(shí)可用特定的波長(cháng)（450nm）測讀吸光值。

ELISA實(shí)驗之比色

比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著(zhù)的液體，然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗，需先將板置于標準96孔的座架中，才可進(jìn)行比色。在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪凈，這樣，此板就可平妥坐入座架中。比色時(shí)應先以蒸餾水校零點(diǎn)，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過(guò)程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計算。

ELISA顯色淡的原因如下：

原因一：試劑盒在運輸途中時(shí)間太長(cháng)，溫度太高。

解決方案：盡量縮短運輸時(shí)間，夏季應放冰塊降溫。

原因二：試劑盒未充分平衡。

解決方案：試劑盒從2～8℃冰箱取出后打開(kāi)盒蓋，于室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫（約25℃）。

原因三：培養箱溫度不足37℃。

解決方案：注意培養箱溫度，放入反應板后盡量減少開(kāi)啟次數以免影響溫度恒定，非隔水式培養箱尤其應注意。

原因四：保溫時(shí)間不足。

解決方案：校正定時(shí)鐘準確定時(shí)。

原因五：洗滌時(shí)沖擊力太大、浸泡時(shí)間過(guò)長(cháng)、洗滌次數增加。

解決方案：按說(shuō)明書(shū)要求保留洗滌時(shí)間，準確記住洗滌次數。

原因六：移液器吸液量不足，吸嘴內壁掛水太多或內壁不清潔。

解決方案：校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時(shí)要緊密，吸嘴內壁要清潔，一次性使用。

原因七：蒸餾水水質(zhì)有問(wèn)題。

解決方案：使用新鮮合格的蒸餾。

原因八：底物作用時(shí)間不足。

解決方案：準確定時(shí)。

上是通慰生物關(guān)于ELISA顯色淡的原因有哪些，希望可以幫助到大家。顯色一定要控制時(shí)間，根據試劑盒說(shuō)明操作即可。一般來(lái)說(shuō)，顯色時(shí)間過(guò)短，結果偏低；顯色時(shí)間過(guò)長(cháng)，空白增高或者非特異性顯色增加。