蛋白定量是生物學(xué)實(shí)驗*的一部分。我們在進(jìn)行蛋白質(zhì)的許多實(shí)驗分析之前都是需要對蛋白質(zhì)的濃度進(jìn)行測定,以便確定下游實(shí)驗是否能順利進(jìn)行。
蛋白試劑盒是常用的蛋白濃度檢測方法之一。該方法原理是蛋白質(zhì)在堿性條件中將銅離子(Cu2+)還原為亞銅離子(Cu+),生成的Cu+與BCA形成紫色絡(luò )合物,并在562nm處具有很強的吸收峰,吸光值與樣品中蛋白質(zhì)的含量成正比,根據吸光值可以推算出蛋白濃度。
通常蛋白定量常使用的方法是比色法,通常用于總蛋白的定量分析。根據蛋白和比色試劑的結合,可以將比色法分為:蛋白-染料結合法和蛋白-銅螯合化學(xué)試劑法。
典型的蛋白試劑盒比色法是考馬斯亮藍G250染料結合法,后者則包括雙縮脲法,Lowry法,二喹啉甲酸(BCA)法。
1、Bradford法
考馬斯亮藍G250染料結合法由MarionBardford博士在1976年提出,因此也叫Bradford法,原理是蛋白在酸性條件下和考馬斯染料結合,染料的吸收值發(fā)生改變,從465nm轉移為610nm,并且在595nm處有的吸收差異。
結合到蛋白質(zhì)分子上的染料數與蛋白所帶正電荷成正比,因此可以用該方法來(lái)對蛋白進(jìn)行定量。染料的顏色變化和蛋白中的堿性氨基酸有關(guān),另外范德華力和疏水作用也會(huì )影響蛋白與染料的結合。
2、BCA法
1985年P(guān)aulK.Smith等人開(kāi)發(fā)出BCA方法,該方法分為兩步:首先,在堿性條件下,蛋白將二價(jià)銅離子還原為一價(jià)銅離子,然后,BCA和一價(jià)銅離子結合,形成紫色化合物,該化合物在562nm時(shí)有吸收,且吸收值與蛋白濃度呈線(xiàn)性相關(guān)。