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細胞株分離的方法有多種，常用的是機械解離細胞法、酶學(xué)解離細胞法以及螯合劑解離細胞法，下面我們就介紹酶解聚方法獲得純化的細胞株。

（1）純化法

在去除不需要的組織后，使用無(wú)菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4 mm小片，通過(guò)懸浮在無(wú)鈣鎂的中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀，去除上清液。重復清洗2到3次。

將盛有組織碎片的容器置于冰上，去除殘留的上清液。加入0.25%溶解在無(wú)鈣鎂的（100 mg組織加入1ml ）。

在4℃孵育6到18小時(shí)，使幾乎沒(méi)有活性的酶盡可能滲透進(jìn)去。

移棄組織碎片中的，在37℃孵育包含殘留的組織碎片20到30分鐘。

在組織碎片加入熱的*培養基，用移液管輕輕地分散組織。如果使用無(wú)血清培養基，要加入大豆抑制劑。

通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)（100～200 mm）過(guò)濾，分散所有剩余組織。計數和接種細胞，進(jìn)行培養。

（2）膠原酶純化法

用無(wú)菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片，用Hanks'平衡液（HBSS）清洗組織碎片幾次。

加入膠原酶（50～200單位/ml，溶解在HBSS中）。

在37℃孵育4到18小時(shí)。加入3mM CaCl2增加解離效率。

通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾細胞懸液，以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的膠原酶。

通過(guò)離心在HBSS中清洗懸液幾次。

再一次在培養基中懸浮細胞，計數和接種細胞，進(jìn)行培養。

（3）Dispase純化法

用無(wú)菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片，用不含鈣鎂的清洗組織碎片幾次。

加入Dispase（0.6～2.4單位/ml 溶解在無(wú)鈣鎂的）

在37℃孵育20分鐘到幾個(gè)小時(shí)。

通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾細胞懸液，以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的Dispase。

通過(guò)離心在中清洗懸液幾次。

再一次在培養基中懸浮細胞，計數和接種細胞，進(jìn)行培養。

分離細胞后，首ci傳代需要注意的問(wèn)題：

傳代培養時(shí)先觀(guān)察細胞的活性。

細胞的活率應該超過(guò)90%，密度控制在80%左右

對于無(wú)血清培養基，需要降低使用量。

（1） 移棄使用過(guò)的細胞培養基。

（2）使用不包含有鈣鎂的或EDTA清洗細胞。在培養瓶背著(zhù)細胞的一面加入清洗溶液，通過(guò)轉動(dòng)培養瓶1到2分鐘清洗細胞層，然后去除清洗液。

（3）加入消化，消化細胞與細胞，操作手法，試劑的效價(jià)有密切的關(guān)系，消化時(shí)應注意觀(guān)察細胞形態(tài)，如細胞變得橢圓透亮，并且可以觀(guān)察到細胞與細胞間的間隙時(shí)，輕拍瓶身可以看見(jiàn)成流沙狀，即可中止消化，消化時(shí)盡量減少對細胞的吹打。

（4）當細胞*分離時(shí)，垂直放置培養瓶，讓細胞流到培養瓶的底部。在培養瓶中加入*培養基中止消化，計數并再次培養細胞。

（5）對于無(wú)血清培養基，加入大豆抑制劑。通常使用1∶1（v∶v）0.25 mg/ml抑制劑到中將抑制活性。

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